Tesis doctoral de la Licenciada María P. Faillace, título: "Participación de la Melatonina en la Fisiología de la Retina del Hámster Dorado"Calificación: sobresaliente, Dpto. de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, U.B.A.
Tesis doctoral de la Licenciada María P. Faillace, título: "Participación de la Melatonina en la Fisiología de la Retina del Hámster Dorado"
Calificación: sobresaliente, Dpto. de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, U.B.A.
Tesis de Licenciatura de la Estudiante Srta. Carolina O. Jaliffa. Título: "Actividad Circadiana del Sistema GabaÈrgico Retiniano"
Dpto. de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, U.B.A.
Tesis de Licenciatura de la estudiante Analía De Nichilo. Título: "Participación del Oxido Nitrico en el procesado de la información fótica"
Presentado en el Departamento de BiotecnologÌa, Universidad Nacional de Quilmes.
Los Glaucomas
Son la segunda causa mundial de ceguera. Conforman un cuadro patológico que tiene innumerables variaciones clínicas, pero un elemento en común que no debe faltar para que la entidad patológica se llame glaucoma es la alteración funcional de la retina y el nervio óptico.
Los Glaucomas generalmente cursan con presión ocular elevada en un altísimo porcentaje y además con alteraciones funcionales de la visión. Es muy raro encontrar glaucomas donde la presión ocular no sea elevada, pero estos casos existen en clínica. Además, las alteraciones de las funciones visuales están siempre presentes cuando la enfermedad se ha declarado o ha comenzado a desarrollarse, porque esta es la evidencia clínica de la alteración funcional de la retina y del nervio óptico.
Cuando hablamos de alteraciones de las funciones visuales estamos hablando de pérdida de campo visual, alteración de la visión de los colores, alteración de la visión de los contrastes y alteración de las respuestas electrofisiológicas.
Para llegar a estas precisiones sobre los glaucomas, pasó mucho tiempo y se produjeron en este período muchos cambios en el conocimiento. Glaucoma deriva de Glaucos que significa blanco. Evidentemente esta es la etapa final del glaucoma y así lo veían los antiguos médicos cuando el paciente llegaba con la córnea blanca, debido al edema que la hipertensión ocular producía sobre este tejido. Mucho tiempo después con la llegada de la tecnología pudo saberse que el glaucoma cursaba con una hipertensión ocular y además con pérdida de las funciones visuales que eran progresivas. Posteriormente nadie dudó del origen hereditario de la enfermedad pero la genética mendeliana no pudo clasificar claramente este origen.
Sin tener claro la fisiopatogenia de los glaucomas los investigadores y los médicos han trabajado en esta enfermedad dándole importancia a la hipertensión ocular generándose una teoría mecanicista donde el rol de la presión ocular era fundamental para lograr las alteraciones de la retina y el nervio óptico y de ese modo generar las alteraciones de las funciones visuales.
En la actualidad los trabajos de experimentación se dividen en el Segmento globo ocular que serían los generadores de la hipertensión ocular y los estudios de Segmento Posterior del globo ocular que serían los estudios orientados hacia las alteraciones de la retina y el nervio óptico.
Estudio de la Relación entre Hipotensores Oculares y Actividad Enzimático Trabecular
El Dr. Benozzi ha trabajado desde 1978 en la fisiopatogenia del glaucoma orientándose al porqué de la hipertensión ocular en su tesis de doctorado.
Estudió la importancia de los glicosaminoglicanos (GAG's) del seno camerular y la acción de las enzimas que actúan en el mecanismo de degradación de los GAG's, estableciendo así el rol de estas sustancias en la regulación de la resistencia al pasaje del humor acuoso en el trabeculado corneoescleral.
La Dra. Rosenstein ha investigado la química y la fisiología retiniana dirigiendo varias tesis doctorales generando numerosas publicaciones internacionales. Su gran experiencia y conocimiento sobre la retina ha permitido que la unión con el Dr. Benozzi resultara en una visión integradora de la enfermedad.
En la primera actividad en conjunto, describieron un mecanismo de acción original de los alfa adrenérgicos para bajar la presión intraocular. Estos aumentan la acción de la enzima hialuronidasa que degradan los GAG's del trabeculado corneo-escleral.
Modelo de Glaucoma Experimental
Basándonos en la experiencia anterior de los glicosaminoglicanos en la hipertensión ocular, decidimos inyectar ácido hialurónico en la cámara anterior de ratas para generar una hipertensión ocular.
Estudiamos los valores de la tensión ocular de ratas genéticamente iguales y normales. En una población de ratas inyectamos semanalmente el ojo derecho con ácido hialurónico y el ojo izquierdo con solución fisiológica.
Observamos que la tensión ocular aumentaba en ojo derecho desde las 24 hs de la inyección, mientras que el ojo izquierdo no variaba. Como el efecto hipertensivo decae a los 9 días, inyectamos cada 7 días para lograr una hipertensión prolongada, semejando el comportamiento de la tensión ocular en el glaucoma de los humanos.
Cuando el modelo estuvo a punto, comenzamos a estudiar las funciones de esos ojos hipertensos para evaluar las alteraciones que se producen.
En síntesis
Hemos logrado reproducir la enfermedad en animales, lo que nos permite dar respuesta a numerosas dudas que la oftalmología tiene sobre los mecanismos que generan el glaucoma y sobre su tratamiento.
Estudio de las Alteraciones Retineanas provocadas por la Hipertensión Ocular en las ratas. Los glaucomas generan cambios patológicos en la retina y en el nervio óptico, algunos conocidos y otros por conocer.
Para confirmar si los ojos de ratas hipertensos generaban los cambios conocidos estudiamos el electroretinograma y la histología de las retinas y nervio óptico. Para detectar cambios desconocidos estamos investigando la histología y la química retiniana.
Electroretinograma en ratas glaucomatosas
Los animales con hipertensión ocular en ojo derecho y normotensos en ojo izquierdo, fueron sometidos a estudios electrofisiológicos semanales para evaluar las respuestas.
A partir de la sexta semana el ojo derecho comienza a disminuir la amplitud de las respuestas con respecto al ojo izquierdo y continúa diferenciándose hasta anular la respuesta.
Esto demuestra un comportamiento similar a los ojos glaucomatosos de los humanos.
Estudio de los cambios oxidativos en la retina de ojos glaucomatosos
El objetivo de este trabajo es estudiar el daño oxidativo inducido por la hipertensión ocular.
Para ello, se analizaron por métodos espectrofotométricos los niveles de glutatión reducido (GSH), la peroxidación lipídica (TBARS) y las actividades de catalasa y glutatión peroxidasa (GPx) en la retina de animales inyectados con ácido hialurónico (AH) o con vehículo en el ojo contralateral (una vez/semana).
Luego de 4 semanas de tratamiento, la actividad de catalasa y los niveles de GSH disminuyeron significativamente. La actividad de GPx y los niveles de TBARS no se modificaron.
Luego de 7 semanas de tratamiento, las diferencias en la actividad de catalasa persistieron y aumentaron significativamente la actividad de la GPx y los niveles de TBARS.
Los niveles de GSH no se modificaron. Estos resultados sugieren que los cambios funcionales e histológicos inducidos por la hipertensión ocular asociada a la inyección intracameral de AH, podrían involucrar una disminución en la actividad de los sistemas de defensa antioxidante. Se postula una asociación entre el glaucoma y el estrés oxidativo.
En síntesis
Nuestro modelo de glaucoma nos permite estudiar cambios en la función y en la química de la retina pudiendo demostrar efectos desconocidos hasta ahora, debidos a la hipertensión ocular.
Detección Precoz de los Glaucomas en Humanos
En la actualidad hemos desarrollado un método electroretinográfico para detectar la enfermedad en los pacientes sospechosos de glaucoma, quiere decir aquellos pacientes que todavía no podemos hacer diagnóstico de glaucoma, pero que tiene algunas evidencias de tenerlo y hemos obtenido resultados muy interesantes como para utilizar ese método en la detección precoz de la enfermedad.
Para que los pacientes glaucomatosos comiencen a perder sus funciones visuales es necesario que la enfermedad haya alterado al menos algunas células retinianas. Hasta ahora comenzamos a tratar a los pacientes cuando detectamos alguna pérdida visual, o sea que la terapéutica comienza cuando la enfermedad ya ha creado daños celulares que probablemente sean definitivos. El electretinograma por patterm permite detectar ese daño muy tempranamente.
Estudiamos pacientes que no tenían pérdidas visuales detectables con nuestro método de electroretinografía y pudimos demostrar que las respuestas eran patológicas. Este estudio descubre los cambios celulares y de los neurotransmisores de la retina antes que se manifiesten con los métodos de estudio tradicionales.
En síntesis
Este nuevo método de detección nos permite identificar a los pacientes con glaucoma que todavía no han desarrollado daños definitivos.
Por lo tanto podemos comenzar el tratamiento antes de los daños irreversibles.
La melatonina en la fisiología retiniana
Durante mucho tiempo, la melatonina fue considerada de origen exclusivamente pineal, aunque más tarde se demostró su síntesis en la retina de diversas especies. Si bien el hámster dorado es el modelo clásico para el estudio de la fisiología de la melatonina pineal, la melatonina retiniana en esta especie había recibido escasa atención. En nuestro laboratorio demostramos que la retina del hámster es un sitio de síntesis activa de melatonina independiente de la actividad pineal. Los niveles retinianos de melatonina varían significativamente a lo largo del ciclo de 24-h, con valores máximos durante la noche y son regulados por la señal fótica tanto in vivo como in vitro. Por otra parte, demostramos que la melatonina incrementa significativamente los niveles de GMPc a través de un aumento de su síntesis e inhibición de su degradación y afecta en forma trascendente la transmisión glutamatérgica retiniana. Asimismo, describimos variaciones en la concentración de receptores retinianos específicos de melatonina a lo largo del ciclo de 24-h. El efecto de la melatonina sobre estos parámetros, estrechamente relacionados con el mecanismo de fototransducción, podrÌa sugerir su participación en el procesado de la información fótica. Estos resultados sugieren que la melatonina retiniana podría constituir una nueva alternativa de comunicación intercelular: una señal "censo-parácrina" o "censo-autócrina", es decir, que se sintetiza y libera primariamente en respuesta al estímulo sensorial y podría afectar en forma trascendente algunos aspectos de la fisiología retiniana. Estos resultados dieron origen a una tesis doctoral, presentada en el Depto. de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, con calificación sobresaliente.
En síntesis
Hemos comprobado la formación de melatonina en la retina y la importancia que ésta tiene en la función visual del ojo humano.
Participación del óxido nítrico en el procesado de la información fótica
El óxido nítrico (NO) desempeña un rol relevante en la fisiología del sistema nervioso, del sistema cardiovascular y del sistema inmune. El NO se sintetiza a partir de larginina en una reacción catalizada por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS). En el sistema nervioso, el mecanismo de acción más conspicuo del NO involucra su interacción con el grupo hemo de la enzima guanilato ciclasa soluble, lo que provoca su activación y consecuentemente el aumento en los niveles de GMPc. Sin embargo, en términos generales se desconocen las consecuencias neurobiológicas de un aumento en el contenido de este nucleótido. En este sentido, la retina constituye una excepción dado que el GMPc es una de las moléculas clave en el mecanismo de fototransducción. Esta estrecha relación entre el NO y el GMPc podría sugerir que el NO participa en el procesado visual. Una condición necesaria (aunque no suficiente) para evaluar la viabilidad de esta hipótesis consiste en demostrar que el sistema nitrérgico retiniano es sensible a la iluminación ambiental. En nuestro laboratorio, hemos caracterizado la actividad de NOS en la retina del hámster dorado. Hemos demostrado que la actividad retiniana de NOS es mayor a medianoche que a mediodía y que está regulada por el estÌmulo fótico. En forma más reciente, hemos caracterizado el sistema transportador de Larginina en este modelo experimental. El influjo retiniano de Larginina, así como los niveles de los ARNms que codifican para estas proteínas son significativamente mayores durante la noche que durante el día. Estas diferencias desaparecen en animales expuestos a condiciones de luz u oscuridad constantes, lo que sugiere su regulación por el estímulo fótico. Asimismo, demostramos que la respuesta inducida por Larginina es significativamente mayor a medianoche que a mediodía. En suma, estos resultados avalan la hipótesis de que el NO podría estar involucrado en la transducción/transmisión retiniana de la señal luminosa.
En síntesis
Hemos reunido evidencias que avalan la participación del óxido nítrico en el procesado de la información visual retiniana.
Estudio multidisciplinario de reacciones de melatonina y óxido nítrico (2)
Esto permite un enfoque computacional-experimental accesible ya que implica interacciones químicas más simples. Las interacciones ligando/receptor, en cambio, requieren no sólo la modelización de la proteína receptora, sólo posible luego de conocer detalladamente su estructura, sino también la eventual interacción de ésta con membranas biológicas, cuya íntima naturaleza química es indudablemente muy compleja. En una primera etapa demostramos por métodos computacionales que la reacción de melatonina con el radical OH es una reacción altamente exergénica. Esta evidencia avala resultados experimentales sobre la capacidad de la melatonina como agente antioxidante. El mecanismo originalmente propuesto para esta reacción no resultó termodinámicamente factible y por ello, hemos propuesto mecanismos alternativos que proceden a través de etapas intermedias con valores negativos de G. A continuación, se analizó la posibilidad de la reacción de melatonina con otro radical libre de gran relevancia funcional, el NO. En este sentido, demostramos que la melatonina es capaz de reaccionar con NO dando al menos un producto estable, la N-nitrosomelatonina cuya estructura fue caracterizada por RMN y cristalografía de Rayos X. Más recientemente hemos demostrado que la melatonina es un potente inhibidor del sistema nitrérgico retiniano que afecta no sólo la síntesis de NO, sino también el influjo de Larginina, y la respuesta inducida por este aminoácido. Al presente estamos examinando las consecuencias fisiológicas de estos resultados. Sin embargo, teniendo en cuenta que ambas moléculas han sido involucrados en diversos procesos retinianos, es muy probable que el cross talk entre dos moléculas relevantes, tenga consecuencias significativas en la regulación de la fisiología retiniana.
En síntesis
Con este trabajo hemos demostrado que la unión de estas dos moléculas, la melatonina y el óxido nítrico, tiene una gran importancia en la estabilización de las funciones visuales.
Actividad circadiana del sistema GABAérgico retiniano (1)
A mediodía de un día soleado, la intensidad luminosa difiere en hasta doce órdenes de magnitud respecto a la medianoche. La capacidad del sistema visual para medir contrastes sobre un background que cambia en este rango de intensidades, es el resultado de un complejo conjunto de mecanismos bioquímicos, morfológicos y neurofisiológicos.
Muchos de estos cambios ocurren agudamente en respuesta a la iluminación ambiental; sin embargo múltiples pruebas experimentales indican que algunas respuestas adaptativas retinianas son también reguladas por osciladores circadianos endógenos. Estos osciladores actúan como relojes que inducen cambios en el sistema visual en función de la hora del día, tomando ventaja de la predictibilidad de los cambios fóticos ambientales. A través de la medición y señalización del tiempo, más que de la intensidad de la luz, un reloj puede inducir cambios adaptativos anticipatorios a los cambios en la intensidad luminosa que ocurren al amanecer o al atardecer. Por lo tanto, es indiscutible que la consideración de mecanismos circadianos es imprescindible para la comprensión de la fisiología retiniana.
Si bien el criterio de oscilador auto-sostenido ha sido satisfecho completamente para los núcleos supraquiasmáticos hipotalámicos (NSQ), la localización de osciladores circadianos en la retina ha sido formalmente demostrado en vertebrados no mamíferos y recientemente se ha demostrado que la retina de hámster in vitro es capaz de sintetizar melatonina en forma rítmica. Esta constituye la primera y por ahora única demostración experimental de la expresión de un reloj intraocular en mamíferos. El ácido-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio de la retina de vertebrados y en este sentido, existe cierta homología con la estructura neuroquímica de los NSQ en los que todas las neuronas son GABAérgicas. Esta evidencia, sumada a la demostración obtenida en nuestro laboratorio del efecto del GABA sobre la síntesis retiniana de melatonina en el hámster, podría sugerir una vinculación causal entre ambos parámetros, de manera tal que la actividad GABAérgica podría ser intrínseca a la ritmicidad circadiana intraocular. En nuestro laboratorio, hemos analizado exhaustivamente el sistema GABAérgico retiniano en el hámster.
Actividad circadiana del sistema GABAérgico retiniano (2)
En forma más reciente, hemos demostrado que la actividad GABAérgica en la retina del hámster dorado, tanto a nivel pre- como postsinóptico, varía significativamente a lo largo del ciclo de 24h, aún en oscuridad constante, lo que sugiere que el sistema GABAérgico retiniano está controlado por la actividad de un reloj circadiano endógeno.
En suma, estos resultados indican que el sistema GABAérgico retiniano podría estar involucrado en la respuesta a la luz y la ritmicidad circadiana, como parte de los mecanismos que participan de la regulación temporal de la fisiología retiniana. Estos resultados dieron origen a dos publicaciones en revistas internacionales.